Acquario

Biofilm di un acquario

Cosa è, quando si crea, utilità.. approfondiamo le trasformazioni biologiche

Premessa

L’avvio di una acquario è un tema complesso che spesso viene sintetizzato nell’unico processo di trasformazione dei composti azotati cioè il ciclo dell’azoto. In realtà il processo è più complesso e richiede delle basi di biologia e chimica per essere ben compreso. Quasi nessuno spiega in maniera approfondita come avvengono alcune trasformazioni biologiche. Per l’appunto un argomento molto sottovalutato ma strettamente legato all’avvio dell’acquario e il suo sviluppo chimico biologico adeguato, è la creazione del/dei biofilm.

In questo articolo sono riportati alcuni concetti già descritti nei precedenti articoli Fasi dell’avvio di un acquario e Nitriti e Nitrati.

Biofilm durante l’allestimento di un acquario

Durante l’allestimento di una acquario possono svilupparsi biofilm sulle superfici interne in acqua o sulla superficie dell’acqua stessa (simili a patine oleose o patine plastiche), con il tempo si possono creare biofilm anche sulle superfici umide intorno l’acquario. Lo sviluppo del “biofilm” sulle superfici in fase di allestimento è necessario perchè è un supporto per i microrganismi che colonizzeranno l’intera biosistema acquatico e permetteranno con il loro sviluppo la stabilizzazione chimica e biologica. Eventuali prodotti chimici o l’inserimento di determinate piante o animali possono modificare lo sviluppo dei biofilm e spostare l’equilibrio chimico verso valori differenti.

Sopra fasi dell’allestimento di acquario gigantesco del grande maestro Amano.

Cos’è un biofilm

Si definisce biofilm la struttura della comunità microbica che si sviluppa in un ambiente, generalmente acquatico o dove è presente acqua (ambiente umido). All’interno degli acquari è fondamentale l’inserimento di un filtro esterno od interno, azionato da una pompa o ad aria perchè i batteri della nitrificazione creeranno il loro biofilm all’interno di esso. In particolare sui materiali biologici si andrà a creare uno strato di biofouling o bio-incrostazione dove si svilupperà il processo di nitrificazione.

Perchè è importante la maturazione di 20-40 giorni circa

Subito dopo aver riempito la vasca questa verrà colonizzata dai batteri e da altri organismi, questi batteri cresceranno secondo il meccanismo del biofilm più sotto descritto. Alla fine del processo che statisticamente richiede circa 20-40 giorni, gli equilibri microbici e la chimica dell’acqua diventano idonee per accogliere i pesci o altri animali acquatici che ci siamo prefissi di allevare, però prima dell’inserimento definitivo è importante misurare i principali valori chimici e fisici che dovranno essere uguali all’intervallo di valori (range) che consentano un ottimale permanenza e salute dei nostri animali nel nuovo acquario. Per i range di allevamento dei pesci o altri animali acquatici che si scelgono di allevare, chiedere nei gruppi, nei forum, o al proprio negoziante di fiducia. Informarsi è importante per evitare delusioni e preservare la salute dei nostri animali acquatici.

I microrganismi che possono colonizzare il nostro acquario possono essere:

  • Organismi come alghe unicellulari e protozoi: 2 – 100 μm circa
  • Funghi (lieviti): 5 – 10 μm circa
  • Batteri: 0,5 – 5 μm circa
  • Virus: 0,01 – 0,3 μm (10 – 300 nm) circa

Riguardo le dimensioni come sempre poi ci sono delle eccezioni, addirittura su focus (la nota rivista) si annovera che il batterio più grande è Thiomargarita namibiensis, ovvero “perla sulfurea della Namibia”. È visibile a occhio nudo: il suo diametro infatti può raggiungere 0,7 millimetri, dieci volte di più di Thiploca, il batterio più grande precedentemente conosciuto. Scoperto alla fine degli anni ’90 al largo delle coste della Namibia, è un organismo sferico unicellulare, che si lascia trasportare dalle correnti marine fino a 100 metri di profondità.

I batteri in acquario sono gli organismi su cui ci si concentra di più perchè sono loro a svolgere alcune funzioni fondamentali che possono precludere la vita e la morte dei nostri pesci. In generale i batteri sono organismi semplici, unicellulari, procarioti, di piccole dimensioni. Le loro spore sono le forme di vita più resistenti conosciute, hanno:

  • resistenza al calore
  • resistenza all’essiccamento (ambienti aridi)
  • resistenza alle radiazioni (U.V. e ionizzanti)
  • resistenza agli agenti chimici tossici

Come esempio di resistenza si possono annoverare le spore di clostridi che possono rimanere vitali per più di 500 anni.

Non meno importanti in acquario sono le alghe unicellulari, i protozoi e i funghi, che formano anche loro biofilm e quindi bio-incrostazioni o biofouling. Di solito in acquario si parla di alghe unicellulari e si comprende cosa sono solo in caso di proliferazione come ad esempio le “volvox” (che producono acqua verde ma non sono le uniche); mentre dei funghi, dei protozoi e dei virus si prende atto della loro esistenza solo quando si parla di specie patogene per i nostri pesci ed invertebrati. Vista la complessità della trattazione di queste categorie riguardo la loro utilità in acquario mi riservo di scrivere articoli dedicati in futuro.

Sopra esempi di alghe unicellulari.

Sopra esempi di organismi unicellulari (alcuni protozoi).

Ciclo dell’azoto

Un processo molto importante che si deve svolgere nel nostro acquario è il famoso ciclo dell’azoto. Questo processo è necessario perchè i nostri animali acquatici producono feci, e urina che si trasforma in ammoniaca (contenente azoto), il processo di decomposizione dell’ammoniaca (o ossidazione dell’ammoniaca) si chiama nitrificazione. Per l’appunto la nitrificazione ad opera di alcuni batteri fa parte del ciclo dell’azoto (vedi figura sotto per una più facile comprensione). Difficilmente si spiega che il ciclo dell’azoto è strettamente legato con l’attività dei microrganismi che formano i biofilm, in quanto anche loro partecipano alla trasformazione della sostanza organica in decomposizione. I microrganismi forniscono una base per tutta la vita sul nostro pianeta catalizzando i processi essenziali dei cicli degli elementi biogeochimici.

In un acquario maturo questa ammoniaca viene decomposta dai batteri,
per questo è importante che il nostro acquario venga colonizzato dai batteri (vedi figura sopra).

I microrganismi forniscono una base per tutta la vita sul nostro pianeta catalizzando i processi essenziali dei cicli degli elementi biogeochimici. Uno di questi processi è la nitrificazione, cioè l’ossidazione dell’ammoniaca in nitrito e successivamente in nitrato; [la nitrificazione è la trasformazione dell’ammoniaca (NH3) e ioni ammonio (NH4+) in ioni nitrito (NO2) e successivamente ioni nitrato (NO3)]. Questo processo di colonizzazione batterica (o maturazione) in un nuovo acquario, come si può vedere nella figura sotto richiede del tempo, ma soprattutto richiede un progressivo aumento del quantitativo di ammoniaca prodotta, che ossidandosi ad opera dei batteri innescherà poi un aumento del quantitativo di nitriti prodotti che a loro volta innescheranno una successiva riossidazione ad opera dei batteri nell’ultimo prodotto che sono i nitrati (molto meno tossici dei nitriti).

Sopra schema indicativo delle variazione e trasformazione dei composti quali ammoniaca, nitriti e nitrati.

Per favorire questo processo in commercio esistono numerosi attivatori batterici ma questo processo, si attiva nella generalità dei casi anche spontaneamente con la  maggior parte delle acque potabili utilizzate, messe all’interno del nostro acquario appena riempito. Facendo dei test giornalieri si può ricavare un grafico simile a quello nella figura sopra. L’ultimo prodotto del ciclo della nitrificazione è il nitrato che dovrà essere misurato e non dovrà superare una certa soglia a secondo degli animali allevati.

Destino del nitrato

  • trasformato per opera di microrganismi,
  • assimilato da microrganismi e piante,
  • rimosso mediante cambi d’acqua.

Da questo se ne deduce che il nitrato è il composto che nel tempo si può accumulare e creare squilibri oltre che l’intossicazione latente dei nostri amati animali acquatici; sottolineo latente perchè i suoi effetti sui nostri pesci o invertebrati sono così graduali da non essere quasi notati.

Tipologie batteriche che trasformano l’ammoniaca

I generi di batteri che ossidano l’ammoniaca sia in acqua dolce che salata sono:

  • Nitrosomonas
  • Nitrosococcus

Mentre i generi che ossidano i nitriti in nitrati sono:

  • Nitrobacter sia in acqua marina che salata
  • Nitrospina solo in acqua salata
  • Nitrococcus solo in acqua salata
  • Nitrospira solo in acqua salata

Generi denitrificanti:

  • Pseudomonas, Bacillus, Thiobacillus (organismi anaerobi facoltativi)

La denitrificazione è uno stadio del ciclo dell’azoto, che avviene sia nel suolo che nelle acque, ed è un processo importante per l’eliminazione dei nitrati, soprattutto negli ambienti acquatici, dove questi composti possono provocare fenomeni di eutrofizzazione.
Durante questo processo i microbi utilizzano il nitrato al posto dell’ossigeno per ottenere l’energia per crescere e moltiplicarsi e, nel farlo, secernono vari enzimi per abbattere i nitrati e ridurli in varie forme di emissioni gassose, sino alla riduzione completa in azoto inerte (N2).

Altre tipologie di ossidazione dell’ammoniaca

Per decenni, la ricerca sulla nitrificazione si è basata sul fermo presupposto che diversi microrganismi ossidanti ammoniaca o nitrito debbano cooperare per catalizzare questo processo. Questo paradigma è stato capovolto da una recente scoperta sorprendente: sono stati trovati ossidanti completi dell’ammoniaca (batteri comammox), che sono in grado di eseguire la nitrificazione completa da soli. Questa scoperta ha rivelato un’inaspettata e ampia lacuna nella nostra conoscenza della nitrificazione: gli organismi comammox sono ampiamente distribuiti nell’ambiente, ma si sa molto poco sulla loro biologia e su come la loro attività potrebbe essere controllata in sistemi e agricoltura. La piattaforma di ricerca Comammox mira a colmare questa lacuna studiando gli enigmatici batteri comammox su diverse scale, che vanno dalle singole molecole alle comunità microbiche complesse e ai processi ambientali.

Ossidazione ammniaca (Comammox): particolare tipo di trasformazione dell’azoto..

Ossidazione completa dell’ammoniaca (comammox) a nitrato da alcuni batteri della stirpe Nitrospira (CMX) potrebbero contribuire al generale ciclo dell’azoto nella rimozione dell’azoto biologico ingegnerizzato (BNR) processi oltre al più ben documentato trasporto di azoto formazioni di batteri ossidanti l’ammoniaca (AOB), batteri ossidanti nitrito (NOB) e batteri anaerobici ossidanti l’ammoniaca (anammox) (AMX). UN è stata condotta un’indagine metagenomica per quantificare la presenza e chiarire la potenziale funzionalità di CMX in 16 configurazioni BNR a grandezza naturale trattamento delle acque reflue mainstream o sidestream. CMX proposto fino ad oggi erano combinato con i genomi AOB, NOB e AMX precedentemente pubblicati per creare un database esteso per l’allineamento delle letture metagenomiche. Le letture metagenomiche assegnate da CMX rappresentavano tra 0,28 e lo 0,64% delle sequenze di DNA codificanti totali in tutte le configurazioni BNR. Analisi filogenetica dei principali geni funzionali della nitrificazione amoA, che codifica per la subunità α dell’ammoniaca monoossigenasi, haoB, che codifica per la subunità dell’idrossilammina ossidoreduttasi, e nxrB, che codifica per la subunità della nitrito ossidoreduttasi, ha confermato che ogni sistema BNR conteneva regioni codificanti per la produzione di questi enzimi da CMX in particolare. In definitiva, la presenza ubiquitaria di batteri CMX e la funzionalità metabolica in tale diverse configurazioni di sistema sottolineano la necessità di tradurre nuove trasformazioni batteriche in processi biologici ingegnerizzati interrogazione, funzionamento e progettazione.

Riprendiamo il concetto di biofilm

Si definisce biofilm la struttura della comunità microbica che si sviluppa in un ambiente, generalmente acquatico o dove è presente acqua (ambiente umido). All’interno degli acquari è fondamentale l’inserimento di un filtro esterno od interno, azionato da una pompa o ad aria perchè i batteri della nitrificazione creeranno il loro biofilm all’interno di esso. In particolare sui materiali biologici si andrà a creare uno strato di biofouling o bio-incrostazione dove si svilupperà il processo di nitrificazione.

Qui sopra un altro schema di come si sviluppa e da cosa è composto un biofilm; i biofilm si creano e “colonizzano” ogni ambiente naturale, la colonizzazione è utile per la trasformazione degli elementi o dei composti inerti in altra sostanza organica e inorganica o in sostanze semplici spesso non tossiche.

Approfondiamo il concetto di biofilm

Altre definizioni più tecniche; un biofilm o biofouling è un aggregato di cellule microbiche associate ad una superficie e incluse in una matrice polimerica extracellulare da esse prodotta.

Una volta che un biofilm si è formato e la matrice esopolisaccaridica è stata secreta dalle cellule sessili, la struttura risultante è altamente viscoelastica con caratteristiche di materiale gommoso.

Purtroppo il termine viene utilizzato spesso impropriamente in diversi settori. Specialmente in Italia si considera il termine biofilm sinonimo di biofouling o di microfouling o di biofilm (microbici) o di biopellicola o slime. In realtà il biofouling (che può dividersi in microfouling e macrofouling) è la comunità e quindi l’insieme dei microrganismi sulla superficie che la incrostano quindi una bio-incrostazione. Come già anticipato il biofilm è solo l’insieme di batteri, cianobatteri, microrganismi e alghe unicellulari, cioè l’insieme degli organismi viventi.

Spesso si parla di microfilm nella “contaminazione biologica” in campo medico o alimentare, e nelle strutture a contatto con biotopi naturali (mare, lago, fiume, montagna, bosco, ecc..). In ambienti marini la creazione del “biofilm”, può evolversi nel microfouling o slime e poi nel macrofouling.

A.G. Nurioglu, A.C.C. Esteves, G. de With, J. Mater. Chem. B 3 (2015)
6547–6570.

La creazione dei biofilm può essere vantaggiosa o svantaggiosa, nel campo alimentare e medico ad esempio è sinonimo e sintomo di contaminazione, nel campo navale è conseguenza di fenomeni di corrosione delle chiglie. La placca batterica ad esempio è un esempio di biofilm incrostante cioè una struttura microfouling.

Qui due esempi di cosa e come porta in pratica lo sviluppo di microrganismi che formano biofilm:
➢ I batteri possono aderire alle superfici ed iniziare la formazione del biofilm anche in presenza di flussi continui, come quelli a cui sono sottoposte le valvole cardiache, specie in presenza di un flusso turbolento.
➢ Si è portati a pensare che il flusso turbolento ostacoli la adesività batterica e la formazione del biofilm invece questi si formano anche in presenza di elevati flussi sia nei sistemi naturali che industriali.

Riportando su un grafico cartesiano in ascissa il tempo ed in ordinata il numero di cellule vitali, si ottiene la curva di crescita batterica, che ci dà un’indicazione dell’andamento della crescita in una popolazione batterica. La curva può essere divisa in quattro sezioni:

Fase di latenza (fase lag): è il periodo impiegato dal microrganismo ad adattarsi all’ambiente.

Fase di crescita esponenziale (fase log): dove il microrganismo si moltiplica velocemente, sfruttando al massimo le risorse dell’ambiente. È possibile mantenere le colture in questa fase trasferendo i batteri in nuovi terreni (coltura continua).

Fase stazionaria (idiofase): dove il microrganismo arresta la sua crescita, poiché uno o più nutrienti sono terminati. I batteri che si dividono e quelli che muoiono sono in equilibrio, alcune cellule entrano in uno stato di latenza in attesa di condizioni migliori. Alcuni batteri in questa fase iniziano a produrre metaboliti secondari (es. antibiotici), che il batterio usa per ridurre la competizione, ostacolando la vitalità di microrganismi potenziali competitori. I metaboliti secondari vengono spesso utilizzati nel campo della ricerca e produzione farmacologica.

Fase di declino (o di morte): dove il numero di microrganismi comincia ad abbassarsi, poiché le cellule morte iniziano a superare quelle in divisione o in latenza. La pendenza della curva è diversa se si contano le cellule vive (maggiore pendenza) oppure corpi cellulari (minore pendenza). Questo perché le cellule muoiono, ma non lisano subito; è possibile fare questa osservazione mediante colorazioni apposite.

Sviluppo dei biofilm

Lo sviluppo del biofilm è una forma comune di crescita batterica in natura. Nelle giuste condizioni ambientali, la maggior parte dei microrganismi è in grado di formare biofilm.

La formazione del biofilm è un processo dinamico e complesso che possiamo suddividere in cinque fasi:

  • Fase 1. Adesione reversibile dei batteri alla superficie. Unione debole dei batteri con il substrato che si verifica in appena 1 minuto.
  • Fasi 2 e 3. Adesione irreversibile alla superficie, con uno stadio iniziale di crescita e divisione con produzione di un esopolimero protettivo e lo sviluppo finale della colonia con dispersione di cellule colonizzanti. I legami irreversibili si formano in un periodo compreso tra 20 minuti e 4 ore.
  • Fase 4. Crescita e maturazione. Le cellule batteriche risultanti formano una microcolonia attorno al sito di legame. Se le condizioni sono adeguate verrà sviluppata una colonia organizzata. Durante tutta la fase di maturazione, il biofilm si adatta alla presenza di nutrienti, ossigeno e cambiamenti di popolazione. Si stima che lo sviluppo di questa fase sia di 2 o 4 giorni.
  • Fase 5. Diffusione di cellule colonizzanti. Infine, alcuni batteri della matrice del biofilm vengono rilasciati da esso per colonizzare nuove superfici, chiudendo o iniziando il ciclo.

Un esempio grafico con alcune micro-fotografie dello sviluppo del biofilm nelle sue cinque fasi. (1) Attaccamento iniziale, (2) Attaccamento irreversibile, (3) Maturazione I, (4) Maturazione II e (5) Dispersione. Ogni fase di sviluppo nel diagramma è accoppiata con una micro-fotografia di un biofilm di P. aeruginosa in via di sviluppo. Tutte le micro-fotografie sono mostrate alla stessa scala.

Fonte: by D. Davis – From: D. Monroe. Looking for Chinks in the Armor of Bacterial Biofilms;. PLoS Biology 5 (11, e307). DOI:10.1371/journal.pbio.0050307.}, CC BY 2.5, https://commons.wikimedia.org/w/ind

Biofilms: strategia di sopravvivenza dei batteri

La crescita nel biofilm aumenta la capacità di sopravvivenza dei batteri attraverso meccanismi come:

  1. Agisce come uno “scudo” che protegge i microrganismi da elementi come biocidi o antibiotici e riduce le possibilità di disidratazione.
  2. Aumenta la disponibilità di nutrienti per la crescita batterica.
  3. Consente il trasferimento di materiale genetico (DNA).

Il processo di formazione dei biofilms, adesione, maturazione, dispersione e recupero, si sviluppa in appena 5 giorni.

L’ammoniaca (NH3)

L’ammoniaca NH3 a temperatura ambiente è un gas incolore dall’odore pungente molto forte, irritante e tossico; è molto solubile in acqua alla quale conferisce una netta basicità, mentre in aria, grazie alla presenza di O2, può intaccare l’alluminio, il rame, il nichel e le loro leghe. L’ammoniaca gioca un ruolo importante nel nostro ambiente in quanto partecipa al ciclo dell’azoto, contribuisce alla neutralizzazione di acidi e partecipa alla formazione di particolato atmosferico, specie quello con diametro aerodinamico minore di 2.5 µm. Ad esempio l’ammoniaca reagisce con l’acido nitrico e con l’acido solforico portando alla formazione rispettivamente di nitrato d’ammonio e solfato d’ammonio, i due sali inorganici maggiormente presenti nel particolato. Le sorgenti maggiori di NH3 comprendono attività agricole (allevamenti zootecnici e fertilizzanti) e, in misura minore, trasporti stradali, smaltimento dei rifiuti, combustione della legna e combustione di combustibili fossili. In particolare, in Regione Lombardia le stime dell’inventario regionale attribuiscono alle attività agricole il 96% delle emissioni di ammoniaca sul totale annuo.

Gli organismi microbici si affidano interamente a composti inorganici a base di azoto per l’energia presenti in ogni ecosistema. La coorte aerobica di questi organismi chemolitoautotrofi guida la nitrificazione, l’ossidazione dell’ammoniaca (NH3) in nitrito (NO2) e nitrato (NO3). I microbi nitrificanti comprendono entrambi i batteri ossidanti NH2-3 e archèobatteri (AOB e AOA, rispettivamente) che effettuano l’ossidazione a 6 elettroni di NH3 a NO2 e batteri NO2 ossidanti 4 (NOB) che effettuano l’ossidazione a 2 elettroni di NO2– in NO3. Recentemente, sono stati identificati batteri “completi ossidanti NH3” (comammox), che mediano l’ossidazione a 8 elettroni di NH3 in NO3.
Poiché la chimica redox delle specie azotofissatori può portare alla formazione di specie reattive dell’azoto come l’ossido nitrico (NO) e il nitrossile (HNO), le fasi biochimiche elementari della nitrificazione richiedono necessariamente un preciso controllo enzimatico sul trasferimento di elettroni e protoni per effettuare la produzione selettiva di intermedi metabolici sulla via. Tuttavia, sono stati compiuti pochi progressi nel chiarire la chimica alla base della nitrificazione, probabilmente a causa delle difficoltà intrinseche del compito. I microbi nitrificanti sono organismi a crescita lenta e per coltivarli in quantità utili dal punto di vista biochimico è necessaria un’apprezzabile abilità microbiologica. Inoltre, molti degli enzimi chiave di nitrificazione che sono stati identificati sono incompatibili con gli approcci tecnologici convenzionali del DNA ricombinante, mentre altri ipotetici enzimi necessari per completare la via metabolica rimangono sconosciuti.

Particolare dei processi AOB e AOA

Quorum sensing

I microorganismi di solito si aggregano formando una microcolonia, prima che la colonia diventi un biofilm deve attivarsi il meccanismo del quorum sensing. Questo avvine quando i batteri iniziano a comunicare tra loro tramite composti chimici che arrivando ad una certa concentrazione (chiamata appunto quorum sensing) si scatena una risposta a cascata che porta alla formazione del biofilm.

Questi composti sono gli autoinduttori e servono a richiamare altri batteri. La sintesi e la captazione di queste peculiari sostanze è un meccanismo che porta alla modulazione dell’espressione genica come risposta ad una determinata molecola; favorendo l’espressione dei geni utili alla sintesi di pili, fimbrie, alla mitosi, al metabolismo, alla biosintesi di polisaccaridi, la sintesi di trasportatori di membrana e la sintesi di fattori sigma alternativi.

In biologia, il quorum sensing o quorum signaling (QS) è la capacità di rilevare e rispondere alla densità della popolazione cellulare mediante la regolazione genica. Ad esempio, il QS consente ai batteri di limitare l’espressione di geni specifici alle densità cellulari elevate alle quali i fenotipi risultanti saranno più vantaggiosi. Molte specie di batteri utilizzano il quorum sensing per coordinare l’espressione genica in base alla densità della loro popolazione locale. In modo simile, alcuni insetti sociali usano il quorum sensing per determinare dove nidificare. Il quorum sensing può essere utile anche per le comunicazioni delle cellule tumorali.
Oltre alla sua funzione nei sistemi biologici, il quorum sensing ha diverse applicazioni utili per l’informatica e la robotica. In generale, il quorum sensing può funzionare come un processo decisionale in qualsiasi sistema decentralizzato in cui i componenti hanno:

  • (a) un mezzo per valutare il numero di altri componenti con cui interagiscono e
  • (b) una risposta standard una volta raggiunto un numero soglia di componenti vengono rilevati.

Foto sopra mostra la spiegazione qui di seguito. I meccanismi degli agenti inibitori del QS nel controllo della formazione del biofilm batterico. I meccanismi degli agenti inibitori della QS nel controllo della formazione del biofilm batterico sono contrassegnati da numeri nel diagramma:

  • (1). Inibire la sintesi delle IA;
  • (2). degradare o inattivare gli IA da AHL-lattonasi, ossidoriduttasi, anticorpi, ecc.;
  • (3). Interferire con i recettori del segnale utilizzando antagonisti dell’IA;
  • (4). Interferire con i regolatori di risposta disturbando la cascata di segnalazione;
  • (5). Riduce l’accumulo di IA extracellulari inibendo l’efflusso di IA, quindi inibisce la segnalazione da cellula a cellula.

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